微塑料的海洋污染在近几年得到国内外学者的普遍关注^[1-2]。微塑料通常是指直径小于5 mm的塑料碎片、颗粒及纤维，根据形成途径的不同，可将其分为两种类型：初级微塑料(工业直接制造的直径小于5 mm的原生微塑料，如带有磨砂颗粒的洁面乳、洗衣粉以及牙膏等)和次级微塑料(较大体积塑料在风力、潮汐等机械作用和紫外线辐射下，破碎、分解形成的二次微塑料)^[3]。研究表明，目前微塑料已经遍布全球^[4-5]，在大西洋东北部发现微塑料密度为2.46个·m^-3[6]。

微塑料对海洋生物的影响研究目前主要集中在滤食性动物(如桡足类、贻贝、牡蛎、磷虾)和蟹、鱼等^[7-12]。用荧光标记的微塑料研究表明，微塑料可以被海洋生物摄入肠道内，附着在口器、附肢等^[9]。微塑料造成的“饱腹感”会降低海洋生物对饵料的摄食，从而导致能量摄入的不足，进一步影响其生殖功能^[13]，如Sussarellu等^[10]用聚苯乙烯微球对太平洋牡蛎暴露两个月，牡蛎卵母细胞的数量、直径和精子速度显著下降，同时被暴露的牡蛎后代的产量和发育也分别有所下降。除了摄食和生殖活动，微塑料还会干扰海洋生物的内分泌，对生长、性发育、繁殖能力产生一定的影响^[1, 14]。附着在体表的微塑料会引起海洋生物游泳等行为的不适，影响其生理活动。微塑料并非只是单纯的进入动物体内再排泄出而不引起其他变化，实验证明紫贻贝摄食微塑料后，会在其肠道和消化道中累积，进一步从肠道转移到循环系统^[7-8]。

目前国内学者也开展了关于中国近海微塑料的分布、转移以及对海洋生物的影响研究^[2, 15-19]。Sun等^[2]以东海浮游动物为研究对象，系统地研究了10个浮游动物类群微塑料的特征、生物累积浓度和残留率，对微塑料的残留和特征进行了系统地论述。武芳竹等^[12]研究发现鱼类摄入微塑料后会存在于其体内组织和器官，对其生殖、发育、代谢、神经系统以及内分泌等都会有一定的影响。微塑料对海洋生物可能会产生两种损伤，一种是物理损伤，另一种是化学损伤^[15]。物理损伤是指微塑料会阻碍生物进行摄食和消化，对肠道带来一定的伤害；化学损伤是指微塑料和有机污染物结合后被摄入生物体内所带来的伤害。微塑料由于具有大的比表面积、疏水性较高，容易与一些重金属离子、持久性有机污染物(POPs，如多氯联苯、滴滴涕、壬基酚等)相互作用并结合在一起，从而对海洋生物造成联合毒性效应^[20]。

海洋桡足类在食物链以及海洋生态系统中具有重要的地位和作用，目前虽然已有少量关于微塑料对海洋生物的生态学影响的相关研究，但微塑料对海洋桡足类摄食生态、行为的影响及其作用机理目前尚不清楚。聚酰胺-6(Polyamid 6，简称PA 6，俗称尼龙6)是由己内酰胺聚合而成的塑料材料，被广泛应用于纤维、工程塑料及薄膜三大领域^[21]，同时也被广泛应用于汽车行业、电子电器市场、家用电器等领域，是目前囯内外产量最大，应用范围最广的一种聚酰胺材料。针对目前微塑料对海洋桡足类影响的研究不足，我们将海洋桡足类短期暴露于微塑料尼龙6中，研究微塑料对其摄食、排泄和生殖的影响，进而分析微塑料对桡足类的生态学及海洋食物网的影响。

以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)作为桡足类的饵料，在温度为(18 ± 1)℃、光照为60 μmol·m^-2·s^-1、光周期为12 L: 12 D的条件下培养至对数生长期后待用。培养藻的海水为经0.45 μm滤膜过滤的pH为8.1、盐度为32的海水，在0.1 MPa条件下高压灭菌20 min，冷却后加入f/2培养基。

选用猛水蚤(Harpacticus sp.)作为实验材料，猛水蚤是胶州湾、汇泉湾海水中常见的底栖桡足类。猛水蚤于2018年11月用200目小型浮游动物网采自青岛鲁迅公园潮间带，暂养于2 L塑料桶中，带回实验室，立即挑取活泼成体进行培养。以浓度为10×10⁴ cells·mL^-1的三角褐指藻作为饵料，盐度调节至30，在室温下培养。取其健康活泼的子代雌体为实验动物。

聚酰胺-6(Polyamid 6，简称PA 6，俗称尼龙6)颗粒，粒径为5~20 μm，购自Sigma Aldrich公司，光学显微镜和扫描电镜照片见图 1。

图 1 尼龙6微粒的光学显微镜(A)和扫描电镜(B)照片Fig. 1 Image of nylon 6 beads in optical microscope (A) and scanning electron microscope (B)

根据Rehse等^[22]设置的微塑料实验浓度，设置尼龙6浓度梯度为0、12.5、25、50、100和200 mg·L^-1 6个浓度梯度，每个浓度梯度不加桡足类(对照组)和加桡足类(实验组)各设置3个平行样。在100 mL聚碳酸酯(PC)瓶中装满饵料浓度为15×10⁴ cell·mL^-1的三角褐指藻藻液，每个瓶中加入10只猛水蚤。固定在转速为1 r·min^-1的摄食轮上，防止藻沉底。实验前，猛水蚤饥饿驯化24 h。猛水蚤摄食24 h后测定饵料浓度，滤水率和摄食率按照Frost^[23]的公式进行计算：

式中：F—滤水率(mL·ind^-1·h^-1)；G—摄食率(cells·ind^-1·h^-1)；V—实验海水体积(mL)；N—猛水蚤数量(ind)；t—摄食时间(h)；C_tf—实验组(加桡足类)最终饵料浓度(×10⁴ cell·mL^-1)；C_t—对照组(不加桡足类)最终饵料浓度(×10⁴ cell·mL^-1)；C₀—起始饵料浓度(×10⁴ cell·mL^-1)。

摄食24 h后，用光学显微镜观察并计数粪便颗粒，单只动物产生的粪便颗粒数即为排粪率(ind·copepod^-1·d^-1)。粪便颗粒尺寸用目镜测微尺测定，并根据形状(椭球体)计算粪便颗粒的体积。按照Cole等^[24]的方法进行粪便沉降速率的测定，即在装满灭菌海水的奈斯勒比色管(高37.5 cm，直径2 cm)管壁上每隔1 cm用记号笔作上标记，室温下将粪便颗粒用吸管吸入、轻轻放入海水中并马上计时，每个处理5个平行样，计算粪便颗粒的平均沉降速率(m·d^-1)。

实验选用饥饿72 h未抱卵的猛水蚤雌体，以保证实验开始时所有猛水蚤雌体生殖状态基本相同。尼龙6浓度梯度设置与1.4部分相同，每一个浓度梯度设置3个平行样，每个实验PC瓶中装满15×10⁴ cells·mL^-1的三角褐指藻藻液，每只瓶中挑入10只未抱卵的成熟雌体，每天记录抱卵数并更新一半藻液，同时将已经抱卵的雌体挑出，并计算抱卵率。

微塑料尼龙6对猛水蚤摄食率、滤水率、排粪率、粪便体积和沉降速率以及抱卵率的抑制率(Inhibition ratio，IR)按照公式IR(%)=(1-T/C)×100%计算，其中T和C分别为微塑料处理组和对照组(0 mg·L^-1)的摄食率、滤水率、排粪率、粪便体积、粪便沉降速率或抱卵率，并利用概率单位法计算半数效应浓度EC₅₀。

每个样品设3个平行样(粪便沉降速率为5个平行)，取平均值±标准偏差。采用t—检验检测数据结果间的显著性差异。

猛水蚤的摄食率(变化范围：0.317×10⁴~1.169×10⁴ cells·ind^-1·h^-1)和滤水率(变化范围：0.018 7~0.070 4 mL·ind^-1·h^-1)变化趋势类似，在暴露微塑料尼龙6 24 h后，摄食率和滤水率比对照组(无微塑料)降低，且均随着微塑料浓度的增大而逐渐降低(见图 2)。与对照组的摄食率和滤水率相比，微塑料浓度200 mg·L^-1时的猛水蚤的摄食率和滤水率分别降低了72.9%和73.4%。微塑料尼龙6对猛水蚤摄食率和滤水率的24 h·EC₅₀分别为67.7和62.2 mg·L^-1。

图 2 不同浓度微塑料尼龙6对猛水蚤摄食率和滤水率的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of microplastic nylon 6 on ingestion rate and clearance rate of Harpacticus sp.

暴露微塑料24 h后，猛水蚤的总排粪率比对照组(无微塑料)降低，且随着微塑料浓度增加而逐渐降低(见图 3)。与对照组的总排粪率(17.8 ind·copepod^-1·d^-1)相比，暴露在微塑料浓度为200 mg·L^-1的猛水蚤总排粪率(8.5 ind·copepod^-1·d^-1)降低了52%。另外，微塑料的存在使猛水蚤排出的粪便颗粒与对照组的粪便颗粒相比尺寸变小，正常粪便平均尺寸为220 μm× 25 μm，异常粪便平均尺寸为31 μm× 21 μm(见图 4)。形状由长椭球体变为短小椭球体(见图 4)，且随着微塑料浓度的增大，每天每只猛水蚤排出的长椭球体的粪便数目越来越少(由17.4个降为4.9个)，而异常粪便(短小椭球体状)数目逐渐增多(由0.4个升高到3.6个)(见图 3)，随着微塑料浓度的升高，异常粪便占总粪便的百分比由2%逐渐升高到42%。微塑料尼龙6对猛水蚤总排粪率和正常排粪率的24 h·EC₅₀分别为221.2和84.1 mg·L^-1。

图 3 不同浓度微塑料尼龙6对猛水蚤排粪率的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of microplastic nylon 6 on pellet production rate of Harpacticus sp.

图 4 暴露于200 mg·L-1微塑料尼龙6摄食24 h后猛水蚤的粪便颗粒Fig. 4 Fecal pellets of Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h

粪便颗粒的体积和沉降速率均随着微塑料尼龙6浓度的增大而降低，对照组中猛水蚤正常粪便的平均体积为7.2 × 10⁴μm³，平均沉降速率为269 m·d^-1，暴露于200 mg·L^-1微塑料尼龙6中24 h后，异常粪便的平均体积为1.01 × 10⁴ μm³，平均沉降速率为31 m·d^-1(见图 5，6)，后者的粪便体积和沉降速率分别比前者降低了86.5%和88.5%，均存在极显著差异(P < 0.01)。微塑料尼龙6对猛水蚤粪便体积和粪便沉降速率的24 h·EC₅₀分别为86.4和50.2 mg·L^-1。

图 5 暴露于微塑料尼龙6摄食24 h后猛水蚤的粪便体积Fig. 5 Volume of fecal pellets in Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h

图 6 暴露于微塑料尼龙6摄食24 h后猛水蚤粪便的沉降速率Fig. 6 Sinking rate of fecal pellets in Harpacticus sp. after exposure to 200 mg·L-1 microplastic nylon 6 for 24 h

微塑料暴露使猛水蚤抱卵延迟导致抱卵率降低(见图 7)，而且微塑料浓度越大，抱卵率降低幅度越大，在第6天，微塑料浓度为0、12.5、25、50、100和200 mg·L^-1的猛水蚤的抱卵率分别为80%，50%，40%，35%，30%和20%。微塑料尼龙6对猛水蚤抱卵率的48、72、96、120、144 h EC₅₀分别为35.3、20.9、63.1、61.3和30.3 mg·L^-1。

图 7 不同浓度微塑料尼龙6对猛水蚤抱卵率的影响Fig. 7 Effects of different concentrations of microplastic nylon 6 on the proportions of gravid female in Harpacticussp.