条斑紫菜隶属于红藻门(Rhodophyta)、原红藻纲(Protoflorideae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Pyropia)^[1]。主要分布于中国黄海、渤海和东海北部沿岸以及日本和朝鲜半岛，是中、日、韩三国共同栽培的紫菜种类，其产业在中国及世界海藻产业中占有重要的经济地位^[1]。条斑紫菜利用丝状孢子体和叶状配子体完成世代交替，此外，其可通过放散单孢子的形式进行无性生殖，为海区生产提供了大量次级苗源^[2]。现有研究表明，Pyropia属红藻单孢子的形成与放散一定程度上影响了藻体的大小与数量，最终决定了其产量^[3]。

目前研究表明，温度、光照、营养盐、海水密度等培养条件的改变均可影响单孢子的形成与放散^[4-7]。此外，尿囊素、硫酸铵等外源物质的添加对单孢子的放散亦具有重大影响 ^{[6, 8-9]}。早期研究发现，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)可诱导野生型的条斑紫菜U-511产生大量放散单孢子的色彩突变体^[2]。然而，近年来，随着紫菜诱变育种技术的不断深入，学者们利用⁶⁰Co γ射线对大量放散单孢子的印度产紫菜(P. chauhanii)野生型品系(PC-WT)进行诱变，进而分离出不放散单孢子且经过数代培养后可稳定遗传的印度产紫菜PC-Y1品系^[10]，这表明单孢子的形成和放散是由基因决定的。此外，条斑紫菜的营养细胞在特化为单孢子的过程中，单孢子细胞的cDNA电泳条带明显减少，说明其遗传信息的表达发生了明显变化^[11]。Kitade等认为，营养细胞在特化为单孢子时，参与卡尔文循环的差异基因显著性表达^[12]；此外，孙迪等^[8]证实培养液中外源尿囊素的添加亦可促进单孢子的大量放散。以上结果说明，单孢子的形成和放散与能量、嘌呤代谢通路密切相关。

本研究通过对条斑紫菜转录组数据库进行同源性搜索和基因注释查找，筛选到一条与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)分生孢子形成基因(abaA)(GneBank登录号：AN0422.2)的同源序列(Contig-21827)，二者编码的氨基酸序列同源性为54.22%。经研究证实：构巢曲霉的分生孢子是借由特化的分生孢子梗经有丝分裂发育而来，新分裂出的单倍体个体与母细胞具有相同的基因型，成熟释放至合适环境中能发育为两个独立的真菌个体；紫菜属的单孢子是由配子体上的营养细胞经有丝分裂特化发育而来，新的单孢子苗携带的遗传信息与营养细胞完全相同且游离的单孢子可以独立发育成完整植株。由此可见，条斑紫菜单孢子形成与子囊菌门(Ascomycota)真菌分生孢子的产生极为相似。本实验类比构巢曲霉分生孢子形成通路和两者的遗传模式进一步分析，发现该基因与条斑紫菜单孢子的形成相关性极大，将其命名为PyMFG。

本研究旨在通过RT-PCR技术克隆得到PyMFG基因的ORF全长并对其进行一系列生物信息学分析，以期为进一步开展条斑紫菜在工程菌中的表达研究与开发合理放散单孢子的紫菜新品种奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本实验所用的条斑紫菜为4个杂交重组品系(PY26W、PY26W'、PY26R、PY26R')，由其野生型品系(U-511，父本)与大量放散单孢子的红色突变体(fre-1，母本)杂交产生的色块分离纯化而来，突变体的获得方法详见Yan^[2]，分离纯化方法同刘美君等^[13]，以上品系在文中简称为W、W'、R、R'。各品系以自由丝状体的形式被保存于实验室中，保存方法同Kato^[14]。丝状体促熟后，刺激其放散壳孢子作为后续实验材料。叶状体的培养条件：(19±1) °C，40 μmol photons/(m²·s)，10 L∶14 D，每5天更换1/2的培养液。培养液为添加MES培养基、比重为1.020的灭菌海水。取以上品系培养至日龄为25、30、35 d时的叶状体，用蒸馏水清洗干净后置于液氮中速冻3~5 min，最后保存至-80 °C冰箱备用。此外，收取日龄35 d的野生型圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)、坛紫菜(WT-8)用做荧光定量PCR验证的材料，其培养温度为(23±1) °C，其他培养条件同上。

1.2   单孢子放散

将条斑紫菜4个重组品系(W、R、W'、R')的壳孢子培养至日龄为20 d时，分别挑选3组大小一致、长势相同的30棵叶状体用作后续实验。首先，每组叶状体置于白色塑料杯中充气培养，翌日用灭菌的镊子取出并放置于盛有新鲜培养液的新塑料杯中继续培养。旧塑料杯中的单孢子置于其适合的生长条件下，待其肉眼可见时，用灭菌毛笔刷下并统计各品系每株叶状体的单孢子日放散量，连续统计15 d后获得单孢子总放散量，以此确定条斑紫菜不同品系的单孢子放散能力。

1.3   条斑紫菜RNA提取及cDNA制备

采用Trizol试剂法^[15]提取条斑紫菜不同品系的叶状体总RNA。首先，取0.1~0.3 g紫菜叶状体，液氮迅速研磨后转入含有1 mL Trizol试剂(Ivitrogen公司)的除酶离心管中。4 °C，12 000×g离心10 min后，向上清液中加入200 μL氯仿抽提，然后经4 °C，12 000×g离心10 min，再次吸取上清液并加入等体积异丙醇离心获得RNA沉淀。然后加入1 mL75%的乙醇(DEPC水配)洗涤沉淀2次，最后在超净工作台中风干5 min，用适量无RNase 水溶解RNA。取1 μg RNA反转录合成cDNA，以此为模板进行后续实验。Trizol试剂购自Ivitrogen公司，反转录试剂盒购于TaKaRa公司，其它药品均为进口分装或国产分析纯。

1.4   条斑紫菜PyMFG基因ORF全长序列克隆

本研究通过对条斑紫菜转录组数据进行同源性搜索和基因注释查找，筛选到一条长1 314 bp的单孢子形成相关基因PyMFG。利用ORF Finder (HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/htaml)在线预测该基因的ORF区后采用NCBI Primer Blast在其ORF区分别设计上、下游引物PyMFG F、PyMFG R，引物序列详见表1。

表 1

25 μL PCR反应体系为Premix rTaq 酶12.5 μL，模板1 μL，无RNase 水10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL。程序设置为94 °C预变性5 min，94 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸2 min，最后72 °C延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测、胶回收纯化(南京诺唯赞)后与pMD-19T载体连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序引物为M13通用引物。Premix rTaq酶、无RNase水、载体、感受态细胞均购于TaKaRa公司，LB培养基购于上海生工生物技术服务有限公司。

1.5   生物信息学分析

PyMFG序列分析

开放阅读框(open reading frame, ORF)分析：根据ORF Finder预测PyMFG的开放阅读框，获取其编码蛋白的氨基酸序列。蛋白质组成分析：应用在线分析工具(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析蛋白质的组成、疏水性、分子量和等电点。蛋白质二级结构分析：应用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)对PyMFG的二级结构进行预测。蛋白质跨膜区分析：应用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质的跨膜区进行预测。功能位点与结构域分析：应用PROSITE数据库(https://prosite.expasy.org/)对蛋白质序列的功能位点进行预测；应用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行结构域分析。亚细胞定位分析：应用TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测该蛋白在胞内的位置。应用NCBI Blastp搜索获得PyMFG所编码氨基酸的同源序列并用Bioedit软件进行同源性分析。应用 MEGA7.0根据邻近法(Neighbor Joining)和最大似然法(Maxmiun Likehood)构建系统发育进化树。

条斑紫菜PyMFG蛋白的空间结构模拟

将条斑紫菜PyMFG蛋白序列提交至Swiss-Model进行建模，得到条斑紫菜PyMFG 蛋白的3D结构模板4ln0。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载4ln0单体结构，使用Pymol软件将预测的PyMFG结构与数据库中的4ln0单体结构进行拟合，模拟PyMFG中相应氨基酸的空间位置。

1.6   实时荧光定量PCR

根据已经得到的cDNA序列，利用NCBI Primer Blast在线设计荧光定量PCR的上、下游引物PyMFG qRT-F和PyMFG qRT-R(表1)。根据坛紫菜18S rRNA序列设计上、下游引物PH18S F和PH18S R(表1)，利用Bio-Rad CFX-96以及SYBR I荧光染料(TaKaRa)完成荧光定量PCR实时检测，程序设置同Koramutla^[16]。首先将该基因进行紫菜种间验证(PY26W'、PS-WT、PC-WT、WT-8)；而后在条斑紫菜PY26品系内(W、W'、R和R')进行品系间验证。不同品种的不同日龄组间分别设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个平行副孔，以PH18S作为内参基因，W品系作为对照组，按照2^−△△Ct法计算基因的相对表达量。定量结果为平均值±标准差，应用Origin 8.5软件对实验数据进行统计分析，并采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异，P<0.05表示差异显著。

2.   结果

2.1 PyMFG部分序列验证

1%的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，PyMFG基因的开放阅读框全长1 224 bp。其编码的氨基酸序列如图2所示，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

图 1

图 2

2.2   PyMFG蛋白特性分析

条斑紫菜PyMFG蛋白的特性分析结果如表2所示，该蛋白的分子量为46.24 ku，等电点为9.08，分子式为C₂₀₆₄H₃₂₅₇N₅₅₉O₆₁₆S₁₅。此外，该蛋白含有较多的丝氨酸与大量疏水性氨基酸。其中，Ile占9.1%、Pro占7.4%、Leu占6.4%、Phe占4.7%、Val占4.2%、Tyr占3.7%、Met占2.2%、Trp占0.5%，总体约占氨基酸总数的42.4%。分析发现，该蛋白为细胞核蛋白，不稳定且具有较强的亲水性。

表 2

条斑紫菜PyMFG蛋白的跨膜区分析结果如表2所示，该蛋白无明显的跨膜α螺旋和信号肽。其二级结构主要由13.02%的α螺旋，14.25%的β-折叠以及72.73%的卷曲构成。同时，该蛋白含有2种、4个多功能位点，分别是长度为1的第28位的多核苷酸结合位点；长度依次为1、3、2的第35~36、321~323、369~370位氨基酸结合位点。

条斑紫菜PyMFG蛋白的结构域预测结果如图3所示，该蛋白含有TEA结合结构域和YAP结合结构域，分别位于ORF的Met1~Arg77区间和Glu143~Glu282区间，属于TEA-ATTS超家族结构域。

图 3

利用Swiss-Model和Pymol对条斑紫菜单孢子形成蛋白(PyMFG)空间结构预测该蛋白由3个α螺旋(H1/H2/H3)，9个β折叠片层以及10个环状连接组成，且TEA结合结构域位于H1螺旋的表面(图4)。

图 4

2.3   同源序列比对与系统发生分析

条斑紫菜的PyMFG基因与NCBI登录的部分产孢物种的孢子形成基因编码的氨基酸多序列比对结果如图5所示，条斑紫菜的PyMFG基因编码的蛋白具有保守的Trp、Ser、Glu、Gln、Ala、Leu、Ile、Gly、Arg、Asn、Val、His。此外，在其编码的第8~46位氨基酸和第62-73位氨基酸处存在2个保守区域，前者以保守的Gly和Glu为主，后者以保守的Arg、Val、Ser、Gln为主。进一步分析发现，该蛋白的两段氨基酸保守区域均位于TEA结合结构域位置。

图 5

为进一步明确条斑紫菜的进化情况，本研究以条斑紫菜PyMFG蛋白为基础，而后从GenBank登录的不同真菌和细菌物种中筛选出13个与孢子萌发、形成有关的蛋白进行氨基酸序列比对后构建的系统发育进化树如图6所示，条斑紫菜PyMFG蛋白并未独立于真菌分生孢子形成蛋白的亚分支，而是与构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus luchuensis)聚为小支后再与葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)等子囊菌门的真菌聚为一个大的亚支，Bootstrap值较大。更重要的是，条斑紫菜并未直接与细菌的不同物种相聚。

图 6

2.4 PyMFG基因的差异表达分析

荧光定量PCR验证

PyMFG基因在紫菜种间的荧光定量分析结果如图7所示。该基因在不放散单孢子的野生型坛紫菜(WT-8)中不表达，在大量放散单孢子的野生型圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)以及条斑紫菜(W’)中能够表达且种间的表达量差异显著。

图 7

PyMFG基因在条斑紫菜不同品系间的荧光定量分析结果如图8所示，该基因在W品系中不表达；在R、R'品系中的表达量相对较低；然而，该基因在W'品系中大量表达且与相同日龄的W、R、R'品系中的表达量差异显著。

图 8

PyMFG基因在条斑紫菜不同品系不同日龄时的荧光定量分析结果如图9所示，PyMFG基因在日龄为25、30、35 d的W品系中不表达；在W'品系中随着藻体日龄的增长，表达量相应增大；然而，在R、R'品系中的表达量相对较低。

图 9

单孢子放散

条斑紫菜4个杂交重组品系(W、R、W'、R’)在日龄为20~35天时每株叶状体的单孢子放散总量如图10所示。W品系在15天内不放散单孢子，R、W'、R'品系每株叶状体的单孢子放散数量较大且R、R'的放散量与W、W'品系具有显著性差异。

图 10