通过对PyMFG基因编码的氨基酸序列分析发现,该基因编码的蛋白质含有TEA和YAP结构域,属于TEA-ATTS超家族。该蛋白结构域家族发现于转录增强因子(TEF)和分生孢子发育调节因子aba中,位于真核转录因子的氨基末端。研究发现,TEAD转录因子家族是发育过程所必需的,其家族成员含有与DNA元件结合的TEA结构域和与转录共激活因子相互作用的反式激活结构域,与传递下游信号息息相关。研究表明,TEAD1可参与上皮细胞的调节分化和上皮形态发生[17]。此外,亦有研究指出,TEAD可结合更具亲和力的TEF-1和TEC1位点,通过磷酸化一种或多种DNA结合表面的丝氨酸(Ser-65,Ser-66和Ser-76),引入静电排斥或空间位阻,干扰与DNA的结合,进而调节TEA/ATTS转录因子活性[18],从而激起下游信号的应答。
研究证实,TEA-ATTS超家族结构域中的TEF与其同源蛋白具有高度保守的真核DNA结合位点,与病毒基因的转录密切相关[19]。TEF-1可以通过N末端的TEAD结合M-CAT原件调节心脏、骨骼和平滑肌的发育且L1环是TEAD协同加载到串联重复的M-CAT DNA结合位点时必需的[18]。研究发现,哺乳动物中存在4种高度保守的TEAD/TEF转录增强因子(TEAD1-TEAD4),需要转录共激活因子的结合才可以激活DNA的转录调控反应[20-21]。除TEF-1外,该家族结构域包含参与Ty1反转录转座子激活过程的酵母蛋白TEC1[20, 22]、控制构巢曲霉分生孢子发育末期反馈调控回路的AbaA蛋白以及调控果蝇自身的发育分化和神经系统中某些特定基因表达的SD蛋白[23-25]。目前研究发现,条斑紫菜单孢子形成过程与子囊菌门(Ascomycota)真菌分生孢子的形成过程极为相似。更重要的是,已有研究证实,TEA结构域家族发现于转录增强因子(TEF)和分生孢子发育调节因子aba中,且构巢曲霉abaA基因的特异性表达能够促使其产生分生孢子头和维持分生孢子产量[26-28]。由此推断,PyMFG蛋白的TEA结构域与条斑紫菜单孢子形成相关基因的转录密切相关。
TEAD包含N末端的DNA结合结构域和C末端的YAP效应结构域,与细胞的发育分化过程密不可分[18, 29]。研究表明,YAP是Hippo途径的末端效应物之一,是参与核心激酶盒的最关键步骤,其主要作用于诱导增殖促进和抗凋亡基因的表达[30-31]。然而,Hippo途径的主要功能是抑制增殖和促进细胞凋亡,从而限制器官的过度生长[32]。研究发现,果蝇(Drosophila melanogaster)中的Hippo途径敲除后导致细胞无限分裂[33]。此外,Hippo途径还可以通过磷酸化和激活细胞质的YAP来抑制YAP-TEAD杂合转录因子发挥作用[29]。更重要的是,在缺乏或阻断 Hippo 信号转导的情况下,未磷酸化的YAP可以进入细胞核作为转录共激活因子,结合并激活TEA家族转录因子 TEAD或SD,进而调控下游靶基因的转录。由此推断,YAP对TEA具有激活、促进作用,猜测两者在条斑紫菜PyMFG蛋白中亦具有相似功能,可能与激活单孢子形成相关基因的转录表达密切相关。
多序列比对结果显示,条斑紫菜的PyMFG基因所编码的蛋白与子囊菌门的构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus luchuensis)、葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida albicans)等分生孢子形成蛋白具有多种相同的保守氨基酸,且Gly、Glu、Arg、Val、Ser、Gln的使用频率较高。然而,所有参与同源序列比对的物种中并未存在一种使用频率更高的保守氨基酸。由此推测,无论是子囊菌门的分生孢子还是条斑紫菜的单孢子,其发育分化过程均需要多种必需氨基酸的共同参与,进化水平较低。
此外,系统发育分析结果显示,条斑紫菜与构巢曲霉和黑曲霉聚为一个小的亚支,充分说明PyMFG基因与其分生孢子形成基因abaA在调控孢子形成方面的保守性,亲缘关系密切。然而,条斑紫菜与细菌聚为的分支呈现极低的Bootstrap值,说明该蛋白与细菌的亲缘关系较远,2物种的孢子形成过程具有较大差异。
目前,关于藻类与真菌的起源进化主要存在2种理论。一种为起源多源论,认为藻类由于色素体的丧失,逐渐由自养生活变为异养生活,从而使自身演变为真菌。另一种理论为鞭毛生物起源论,认为藻类和真菌起源于同一种单细胞原始水生鞭毛生物,其鞭毛数量不一,个体间叶绿素和其他色素有无、含量方面均存在差异。因此,随着进化时间的推移,本身具有色素的个体演化为藻类,而不具有色素的个体演化为真菌[34]。综上所述,本研究得出的条斑紫菜单孢子形成基因(PyMFG)编码的蛋白与构巢曲霉、黑曲霉等子囊真菌分生孢子形成蛋白亲缘关系更近的结果较为合理,为后续研究单孢子形成与放散的分子生物学机制提供了方向和理论支持。
培养观察发现,单孢子的形成与放散是一个连续的过程,其形成或放散并不能以单一生物学过程独立存在于其无性生殖过程中。单孢子最终放散的数量与速度取决于其形成的数量与速度,单孢子在不形成时亦不会从藻体释放。本实验通过荧光定量分析发现,PyMFG在不放散单孢子的坛紫菜(WT-8)中不表达,在大量放散单孢子的圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)以及条斑紫菜(W')中表达且种间的表达量差异显著,充分说明该基因与单孢子形成的密切相关性。
单孢子放散实验发现,W品系不放散单孢子,R、W'、R'品系能够大量放散单孢子且放散总量差异显著。此外,PyMFG基因在父本品系(W)中不表达,与单孢子放散实验结果相符。在偏父本品系(W')中的相对表达量随藻体日龄的增长日趋增大,放散能力增强,与单孢子放散实验结果相符。然而,该基因在母本品系(R)与偏母本品系(R')中的相对表达量变化与两者大量放散单孢子的性状存在差异。推测两品系单孢子形成和放散的基因与父本品系(W)和偏父本品系(W')存在本质性差异,而这与其杂交母本(fre-1)发生的点突变息息相关。
大量放散单孢子的条斑紫菜红色突变体(fre-1)是由野生型条斑紫菜(U-511)经化学诱变剂甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱变而来[2]。化学诱变导致多种点突变位点产生,从而使诱变品系(fre-1)获得大量与单孢子形成和放散相关的基因,进而促进自身单孢子的形成和大量放散。然而,基因是有遗传效应的DNA片段,且遗传重组主要发生在染色体的四分体时期。由此推测,大量放散单孢子的条斑紫菜红色突变体(fre-1,母本)与野生型条斑紫菜(U-511,父本)杂交时仅重组少量相关基因片段和基因种类给父本品系(U-511),从而使重组的偏父本品系(W')具有大量放散单孢子的性状。然而,母本品系(R)和偏母本品系(R')则保留了大量不同于父本品系的单孢子形成和放散的基因,这些基因可能是参与单孢子形成的上游调控元件基因、关键形成基因以及参与其放散的细胞壁分解酶基因。更重要的是,该部分基因可能与偏父本品系中的PyMFG基因在调控单孢子形成和放散时的相互作用网络存在差异。由此推测,此性状的发生至少由一对等位基因控制。
不同紫菜种间的荧光定量PCR实验证实了PyMFG基因与紫菜属的某些红藻形成和放散单孢子的性状密切相关。此外,本研究根据单孢子放散实验和荧光定量PCR实验推断出大量放散单孢子的条斑紫菜品系中存在大量调控单孢子形成和放散的基因,至少有1对等位基因参与调控其形成和放散,从而使上述结果存在差异。此外,条斑紫菜的PyMFG蛋白含有TEA结合结构域,与构巢曲霉和黑曲霉的分生孢子形成蛋白AbaA属近缘同源蛋白,可能作为转录调控因子调节其单孢子的形成,为后期研究条斑紫菜单孢子形成和放散的分子生物学机制提供了方向,进而为开展条斑紫菜在工程菌中的表达研究和开发合理放散单孢子的紫菜新品种提供了理论支持。然而,以上实验结果为推断与预测,PyMFG基因具体的分子生物学功能还需通过实验进一步验证。